染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）

染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA 相互作用的信息。ChIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且，ChIP與其他方法的結(jié)合，擴大了其應(yīng)用范圍：ChIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。由此可見，隨著ChIP的進(jìn)一步完善，它必將會在基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

實驗流程：

甲醛處理細(xì)胞→收集細(xì)胞，超聲破碎→加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合→加入ProteinA，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀→對沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結(jié)合→洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物→解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷→PCR分析。

具體操作：

第一天:

一、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎。

取出細(xì)胞，加入甲醛，使得甲醛的終濃度為1%。

37℃孵育10min。

終止交聯(lián)。

吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。

細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15ml離心管中。預(yù)冷后離心收集細(xì)胞。

倒去上清。

超聲破碎。

二、除雜及抗體孵育

超聲破碎結(jié)束后，離心去除不溶物質(zhì)。

在100μl的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900μl ChIP Dilution Bufer 和20μl × PIC。再各加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃顛轉(zhuǎn)混勻1h。

1h后，在4℃靜置10min沉淀，700rpm離心1min。

取上清。各留取20μl做為input。一管中加入1μl抗體，另一管中則不加抗體。4°C顛轉(zhuǎn)過夜。

三、檢驗超聲破碎的效果

取100μl超聲破碎后產(chǎn)物，加入4μl 5M NaCl，65℃處理2h解交聯(lián)。分出一半用酚/氯仿抽提。

電泳檢測超聲效果。

第二天:

免疫復(fù)合物的沉淀及清洗

孵育過夜后，每管中加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃顛轉(zhuǎn)2h。

4℃靜置10min后，離心除去上清。

清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟:加入溶液，在4℃顛轉(zhuǎn)10min，4℃靜置10min沉淀，700rpm離心1min，

除去上清。

清洗完畢后，開始洗脫。

解交聯(lián):每管中加入20μl 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）?；靹颍?/span>65℃解交聯(lián)過夜。

第三天:

一、DNA樣品的回收

解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1μl RNAaseA(MBI) ，37℃孵育1h。

每管加入10μl 0.5M EDTA，20μl 1M Tris.HCl（pH6.5），2μl 10mg/ml蛋白酶K。45℃處理2h。

DNA片段的回收-omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100μl ddH2O。

二、PCR分析。

技術(shù)結(jié)合

CHIP-seq的原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進(jìn)行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等相互作用的DNA區(qū)段信息。

染色質(zhì)免疫共沉淀-芯片（ChIP-chip）：ChIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIP-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選。ChIP-chip 技術(shù)的發(fā)展為分析活細(xì)胞或組織中DNA與蛋白質(zhì)的相互關(guān)系提供了一個極為有力的工具。在未來的研究中，將對芯片的構(gòu)建進(jìn)行改進(jìn)，提高其實用性。使用易于獲得的抗體，增加這種方法的可用性。

技術(shù)應(yīng)用

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)主要應(yīng)用于：組蛋白的修飾研究；染色質(zhì)表觀遺傳修飾研究；轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析；藥物開發(fā)研究；有絲分裂研究；DNA損傷與凋亡分析等。

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